反相高效液相色譜柱采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶人色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并進(jìn)入檢測器檢測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。
反相高效液相色譜柱按溶質(zhì)在兩相分離過程的物理化學(xué)原理分類：
(1)吸附色譜
用固體吸附劑作固定相，以不同極性溶劑作流動(dòng)相，依據(jù)樣品中各組分在吸附劑上吸附性能的差別來實(shí)現(xiàn)分離。
(2)分配色譜
用載帶在固相基體上的固定液作固定相，以不同極性溶劑作流動(dòng)相，依據(jù)樣品中各組分在固定液上分配性能的差別來實(shí)現(xiàn)分離。根據(jù)固定相和液體流動(dòng)相相對極性的差別，又可分為正相分配色譜和反相分配色譜。
(3)離子色譜
用高效微粒離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，依據(jù)離子型化合物中各離子組分與離子交換劑上表面帶電荷基團(tuán)進(jìn)行可逆性離子交換能力的差別而實(shí)現(xiàn)分離。
(4)體積排阻色譜
用化學(xué)惰性的多孔性凝膠作固定相，按固定相對樣品中各組分分子體積阻滯作用的差別來實(shí)現(xiàn)分離。
(5)親和色譜
以在不同基體上，鍵合多種不同特性的配位體作固定相，用具有不同pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，依據(jù)生物分子(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核堿、核苷、核苷酸、核酸、酶等)與基體上鍵聯(lián)的配位體之間存在特異性親和作用能力的差別，而實(shí)現(xiàn)對具有生物活性的生物分子的分離。
